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影響重組腸激酶活性的因素有哪些

發布時間:2022-07-20      點擊次數:34
  腸激酶(Enterokinase,EK,EC3.4.21.9)是一種異源二聚體形式存在于哺乳動物十二指腸內的絲氨酸蛋白酶。它能高效專一性的水解工程菌表達的融合蛋白(識別位點是Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)釋放出目的蛋白,被廣泛用于生物工程制藥的開發。牛腸激酶由一條結構亞基(重鏈)和一條催化亞基(輕鏈)構成,二者以二硫鍵結合。據報道,重組腸激酶輕鏈體外具有全酶的酶切特異性,同時對基因工程融合蛋白底物的酶切活性較提純的牛腸激酶明顯增強。天然腸激酶來源有限,且從動物組織提取的腸激酶易污染其他蛋白,給實際應用帶來了困難。這就要求用基因工程方法生產高純度的腸激酶。重組腸激酶可以切割含有四個天冬氨酸的賴氨酸羧基端肽鍵:天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-賴氨酸(DDDDK)??梢栽谳^寬pH范圍(4.5-9.5)和較寬溫度范圍內有效切割融合蛋白。重組腸激酶可去除位于蛋白質N-末端的融合蛋白,以除去不需要的融合標簽。
  常見影響腸激酶活性的因素:
  在>200mM咪唑,或>200mMNaCl,或>5%甘油,酶切效果受影響??蓞⒄找韵峦扑]方法進行酶切:
  1)為獲得理想酶切結果,請將樣品透析到25mMTris-HCl8.0緩沖液中,再進行酶切。
  2)若不便透析,可將樣品稀釋,咪唑含量在100mM以下,NaCl濃度在50mM以下,甘油濃度小于5%以下進行酶切,酶的用量與蛋白的比例不變(即1U酶切500µg蛋白)。
  3)如果樣品溶液中含有上述成分中的一種或多種,且不便去除,此時適當增加酶量或延長酶切時間,也可達到較好酶切效果。
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