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EZ 488 TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(綠色熒光)

簡要描述:EZ 488 TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(綠色熒光)采用 TUNEL 法,應用末端脫氧核糖核苷酸轉移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)在凋亡細胞斷裂DNA 的3´-OH末端催化摻入EZ 488-dUTP。EZ 488-dUTP標記的 DNA 可以用熒光顯微鏡直接觀察或者用流式細胞儀定量。

  • 產品型號:AC12L054/AC12L055
  • 廠商性質:生產廠家
  • 更新時間:2021-05-17
  • 訪  問  量:259

詳細介紹

品牌自營品牌貨號AC12L054/AC12L055
規格20T供貨周期現貨
主要用途可以選擇性的檢測凋亡細胞應用領域生物產業

EZ 488 TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(綠色熒光)

產品描述
  本產品與roche No1684817/Merck QIA33等產品相比更具優勢及替代性,可詳見下文或咨詢銷售人員。

  細胞凋亡的一個顯著特點是細胞染色體 DNA 的降解,這是一個較普遍的現象。這種降解非常特異并有規律,所產生的不同長度的 DNA 的片段約為 180 bp-200 bp 的整數倍,表現為瓊脂糖凝膠電泳中呈現特異的梯狀 Ladder 圖譜,EZ 488 TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(綠色熒光)采用 TUNEL 法,應用末端脫氧核糖核苷酸轉移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)在凋亡細胞斷裂DNA 的3´-OH末端催化摻入EZ 488-dUTP。EZ 488-dUTP標記的 DNA 可以用熒光顯微鏡直接觀察或者用流式細胞儀定量。TUNEL 法可以選擇性的檢測凋亡細胞,而非壞死細胞或因輻照和藥物治療而造成的 DNA 鏈斷裂的細胞。TUNEL 實驗中, TdT 酶催化 dUTP 摻入斷裂的 DNA 鏈的3´-OH末端??乖瓨擞浀?dUTP(如digoxin-dUTP、生物素-dUTP),因為它可以直接進行原位檢測,是一種更快速、直接的檢測手段。
訂購信息

產品名稱貨號規格價格
EZ 488 TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒 (綠色熒光)AC12L05420T1880
EZ 488 TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒 (綠色熒光)AC12L05550T3480


產品組分

組分20T50T
  1. TUNEL Equilibration Buffer
2×1 mL5 mL
  1. EZ 488 TUNEL Reaction Buffer
2×0.5 mL5×0.5mL
  1. TdT Enzyme
20 μL50 μL
  1. Proteinase K (2 mg/mL)
40 μL100 μL
  1. DNase I (2 U/μL)
5 μL13 μL
  1. 10 × DNase I Buffer
100 μL260 μL


運輸與保存
  藍冰運輸。-20℃保存;組分B需避光保存于-20℃,避免反復凍融。有效期24個月。
【注】:組分A、B中含有有毒、致癌成分Sodium cacodylate trihydrate和Cobaltous chloride,使用時請佩戴 kou zhao、手套,接觸皮膚后,請立即有大量水沖洗,廢液請按有毒物質處理。
實驗材料(自備)

  PBS 緩沖液(pH~7.4)
  4%多聚 jia quan(in PBS
  牛血清白蛋白 (BSA) 或正常的羊、牛血清
  70%乙醇(自選)
  脫蠟溶劑(石蠟切片樣本)
操作步驟

1.樣本準備:
細胞樣品
1可選:準備份陰性對照樣本(加入不含 TdT 酶的TUNEL 反應液)。
2PBS清洗細胞兩次。
3細胞固定:加入適量 4% 多聚
 jia quan(pH 7.4)溶液, 4℃ 放置 30 min。
4PBS清洗細胞2次。
5通透細胞:加入冰上預冷的 70%乙醇,在-20℃孵育 4 h。細胞能在 70%乙醇中-20℃的條件下保存1周?;蛘呒毎捎门渲朴?PBS 中的 0.2% Triton X-100 溶液通透,室溫放置 20 min。
6PBS清洗細胞2次。
石蠟組織切片
1室溫下用二甲苯浸泡石蠟組織切片2次,每次5 min,以徹底脫掉石蠟。
【注】:二甲苯有毒,易揮發,請在通風櫥中進行此操作。
2室溫下,將切片樣本浸沒于無水乙醇中漂洗2次,每次5 min。
3室溫下,將切片樣本連續浸沒在不同濃度梯度的乙醇(95%、90%、80%、70%)中,每種濃度各漂洗1次,每次5 min。
4室溫下,將切片浸沒于純水中漂洗1次,每次3 min,再將切片浸沒于1×PBS中漂洗1次,每次3 min,用濾紙小心吸干切片樣本周圍多余液體。
5用免疫組化筆在切片樣本周圍描繪樣品輪廓,以便下游通透與標記。
6按1:100的比例, 將2 mg/mL的Proteinase K溶液用1 × PBS稀釋,使其終濃度為20 µg/mL。每個樣本上滴加100 µL稀釋好的Proteinase K溶液, 使溶液覆蓋全部樣本區域, 室溫孵育20 min(Proteinase K 的孵育時間、溫度需根據不同類型組織樣本進行優化)。
【注】:蛋白酶K可以幫助滲透組織,但延長孵育時間可能導致切片脫落,所以要優化合適的孵育時間長短。時間一般為10~30 min,4 µm左右的片子可以用10 min,但30 µm左右的可用30 min。過長易脫片、過短起不到通透效果。
7PBS 浸潤清洗切片2次,每次 5 min,用濾紙吸去多余的液體,將處理好的樣品放在濕盒中保持濕潤。
【注】:這一步必須把蛋白酶K洗滌干凈,否則會嚴重干擾后續的標記反應。
冰凍組織切片
1將冰凍切片放置于室溫的片架上,室溫20 min,晾干。
2將載玻片浸沒在4%多聚
 jia quan溶液(in PBS)中,室溫固定30 min。
3PBS 浸潤清洗切片2次,每次5 min。
4用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。
5按1:100的比例, 將2 mg/mL的Proteinase K溶液用1 × PBS稀釋, 使其終濃度為20 µg/mL。每個樣本上滴加100 µL稀釋好的Proteinase K溶液, 使溶液覆蓋全部樣本區域,室溫孵育10 minProteinase K 的孵育時間、溫度需根據不同類型組織樣本進行優化)。
【注】:蛋白酶K可以幫助滲透組織,但延長孵育時間可能導致切片脫落,所以要優化合適的孵育時間長短。時間一般為10~30 min,4 µm左右的片子可以用10 min,但30 µm左右的可用30 min,需摸索最佳時間。過長易脫片、過短起不到通透效果。
6PBS 浸潤清洗切片2次,每次 5 min,用濾紙吸去多余的液體,將處理好的樣品放在濕盒中保持濕潤。
陽性處理(僅陽性對照進行此步驟,其他樣品直接進行TUNEL反應步驟)
1按1:10的比例用ddH2O將10 × DNase I Buffer稀釋成1 × DNase I Buffer備用。
2滴加100 µL 1 × DNase I Buffer到已通透的樣本上,室溫平衡5 min。
3用1 × DNase I Buffer 以1:100稀釋DNase I (2 U/μL),使其為終濃度20 U/mL的工作液。
4輕輕吸掉多余液體,加入100 μL濃度為20 U/mL DNase I工作液,室溫孵育10 min。
5輕輕吸掉多余液體,PBS清洗樣品2次。
2. TUNEL 反應
1每個樣本加入 100 μL TUNEL 平衡緩沖液,孵育 5 min。
2預先配制 TUNEL 反應混合液:每個樣本需要已加入1 μL TdT 酶的 50 μL TUNEL 反應緩沖液。
3棄去平衡緩沖液,用濾紙小心吸去切片樣本周圍的多余液體,每個樣本加入 50 μL TUNEL 反應混合液。
a.貼壁細胞,用蓋玻片使緩沖液均勻覆蓋樣本。37℃避光孵育 60 min。
b.懸浮細胞,可加入微孔板中,采用微孔板振蕩器進行孵育或每隔 15 min 溫和的震蕩反應管,使之充分反應。37℃避光孵育 60 min。
c.組織樣本,用蓋玻片使緩沖液均勻覆蓋樣本。將樣本平放于濕盒內,37℃恒溫箱孵育2 h,濕盒底部鋪一張含少量水的紙巾保持濕度。37℃避光孵育 2 h。
4去掉反應液,在1×PBS 的染色缸中浸泡潤洗2次,每次5 min。再使用適量配制于 PBS 中的 0.1% Triton X-100,其中含 5 mg/mL BSA 的緩沖液清洗樣本3 次,每次5 min,以降低背景。
5(可選)復染:每個樣本滴加濃度為2 μg/mL 的DAPI染液,避光室溫孵育10 min。染色完后,輕輕去掉染液,并將樣本在1×PBS中浸泡潤洗3次,每次5 min。
6(可選)封片:將切片樣本先純水浸沒5 min,再放入70%乙醇浸沒5 min,再80%乙醇浸沒5 min,90%乙醇浸沒5 min,95%乙醇浸沒5 min,無水乙醇浸沒5 min,最后將切片樣本置于染色缸中以新鮮的二甲苯浸泡透明化處理2次,每次5 min(通風廚中操作)。脫水完成后,擦去切片周圍的液體,每個切片樣本滴加50 μL抗熒光淬滅封片液,蓋上蓋玻片,用鑷子的鈍端輕輕敲擊蓋玻片,去除氣泡以使封片完全。
7用熒光顯微鏡或流式細胞儀觀察、分析,EZ 488是一種綠色熒光染料,激發波長、發射波長分別為 485 nm,515 nm(凋亡細胞應被標記上明亮的綠色熒光,沒有加入TdT 酶的陰性對照樣本未被標記上熒光)。
注意事項

  1. 產品僅限于科學實驗研究使用,不得用于臨床診斷、治療等領域。
  2. 熒光染料均存在淬滅問題,保存和使用過程中請盡量注意避光,以減緩熒光淬滅。
  3. 為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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